Se requieren límites de dominio de asociación topológica para la función normal del genoma

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 435 (2023) Citar este artículo

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Los límites del dominio de asociación topológica (TAD) dividen el genoma en territorios reguladores distintos. La evidencia anecdótica sugiere que su alteración puede interferir con la expresión genética normal y causar fenotipos de enfermedades1,2,3, pero aún se desconoce el alcance general en el que esto ocurre. Aquí demostramos que las eliminaciones específicas de los límites de TAD causan una variedad de alteraciones en la función normal del genoma in vivo y el desarrollo del organismo. Utilizamos la edición del genoma CRISPR en ratones para eliminar individualmente ocho límites TAD (de 11 a 80 kb de tamaño) del genoma. Todas las eliminaciones examinadas dieron como resultado fenotipos moleculares u orgánicos detectables, que incluyeron interacciones de cromatina alteradas o expresión genética, viabilidad reducida y fenotipos anatómicos. Observamos cambios en la arquitectura local de cromatina 3D en 7 de 8 (88%) casos, incluida la fusión de TAD y frecuencias de contacto alteradas dentro de TAD adyacentes al límite eliminado. Para 5 de 8 (63%) loci examinados, las eliminaciones de límites se asociaron con una mayor letalidad embrionaria u otros fenotipos de desarrollo. Por ejemplo, una eliminación del límite TAD cerca de Smad3/Smad6 causó una letalidad embrionaria completa, mientras que una eliminación cerca de Tbx5/Lhx5 resultó en una malformación pulmonar grave. Nuestros hallazgos demuestran la importancia de las secuencias límite de TAD para la función del genoma in vivo y refuerzan la necesidad crítica de considerar cuidadosamente la patogenicidad potencial de las deleciones no codificantes que afectan los límites de TAD en el cribado de genética clínica.

Los genomas eucariotas se pliegan en dominios de asociación topológica (TAD), segmentos de cromatina de escala submegabase caracterizados por una alta frecuencia de contacto de cromatina intradominio4,5,6. Los TAD representan una característica clave de la organización jerárquica del genoma al definir vecindarios de cromatina dentro de los cuales pueden interactuar las secuencias reguladoras, al mismo tiempo que aíslan las interacciones regulatorias a través de los límites5,7,8,9,10. Los límites de TAD se definen y miden principalmente mediante ensayos de conformación de cromatina, y generalmente se asocian con un conjunto característico de proteínas, incluido el factor de unión a CCCTC (CTCF), componentes del complejo de mantenimiento estructural de los cromosomas (SMC), como la cohesina y la condensina, y ARN polimerasa II5,11,12,13,14. Los TAD se forman como resultado de la extrusión de bucles, en la que las hebras de ADN se deslizan desde el interior del complejo de cohesina o SMC hasta que se encuentran las moléculas de CTCF unidas en una orientación convergente13,15,16,17,18,19. La pérdida de CTCF, cohesina o el factor de carga de cohesina Nipbl da como resultado la alteración de TAD, mientras que la pérdida del factor de liberación de cohesina, Wapl, da como resultado un refuerzo de los límites de TAD20,21. Curiosamente, ~20% de los límites de TAD permanecen estables tras la pérdida de CTCF22. Tanto los mecanismos mediados por CTCF como la transcripción pueden afectar la formación y función de los TAD, pero ninguno parece ser suficiente individualmente ni requerido universalmente7,11,23,24. Por lo tanto, el estado de la cromatina, la actividad transcripcional y la organización TAD pueden influirse entre sí, y la estructura nuclear observada de los genomas de los mamíferos probablemente sea el resultado de su compleja interacción7,11,23,24,25.

Las ubicaciones genómicas de los límites de TAD están bien conservadas en todas las especies de mamíferos, lo que indica que su función y posiciones dentro del genoma están sujetas a restricciones evolutivas5,26,27,28. Esta noción está respaldada aún más por el agotamiento general de variantes estructurales en los límites de TAD observado en la población humana general26, mientras que las alteraciones y reordenamientos de la estructura de TAD han sido implicados en la expresión errónea de genes y están asociados con fenotipos de desarrollo y cáncer1,2, 3,29,30. Sin embargo, la mayoría de estas alteraciones fueron grandes mutaciones estructurales que ocurrieron espontáneamente y que también incluían características genómicas vecinas, como elementos reguladores y/o genes codificadores de proteínas. Por lo tanto, no se comprende bien el papel específico de los límites TAD en estos fenotipos. En el presente estudio, examinamos la necesidad funcional de las secuencias límite de TAD in vivo. Seleccionamos ocho límites TAD independientes en las proximidades de genes activos durante el desarrollo embrionario, eliminamos individualmente estos límites del genoma del ratón y examinamos sistemáticamente las consecuencias sobre la supervivencia, la organización del genoma, la expresión genética y el desarrollo. Las ocho eliminaciones de límites de TAD provocaron alteraciones de una o más de estas propiedades. También observamos que la pérdida de límites con más sitios CTCF generalmente resultó en fenotipos más severos y que los fenotipos de organismos más severos coincidieron con cambios pronunciados en la conformación de la cromatina. En combinación, nuestros resultados indican que las secuencias límite de TAD son necesarias para la función y el desarrollo normales del genoma.

Para evaluar las funciones in vivo de las secuencias límite de TAD, nos centramos en los límites que flanquean a los TAD que albergan genes con expresión y función conocidas durante el desarrollo embrionario para facilitar la detección de fenotipos resultantes de la eliminación de límites. A partir de un conjunto de >3300 límites TAD previamente anotados en todo el genoma5,10, calificamos y priorizamos cada límite según los siguientes criterios: (1) ocupación de CTCF agregada de 62 conjuntos de datos CTCF ChIP-seq publicados, que sirvieron como proxy para el resistencia general esperada del aislamiento (conjuntos de datos enumerados en Datos complementarios 1); (2) coocupación de subunidades del complejo de cohesina y el factor de transcripción Znf14331 de 38 conjuntos de datos ChIP-seq publicados (Datos complementarios 1); (3) Conservación vinculante para CTCF en regiones ortólogas en cuatro especies de mamíferos diferentes32 (Datos complementarios 2); y (4) si ambos TAD flanqueantes contienen genes con funciones conocidas en el desarrollo embrionario, mostrando preferentemente patrones divergentes de expresión específica de tejido (Fig. 1, Fig. 1 complementaria, Datos complementarios 1 a 3, "Métodos"). Se excluyeron los límites TAD que abarcaban genes codificadores de proteínas. Después de la priorización de todo el genoma, seleccionamos y eliminamos 8 límites TAD individuales del genoma del ratón mediante inyección pronuclear de óvulos fertilizados usando CRISPR/Cas9. Para todas las eliminaciones, los límites exteriores de los límites se definieron mediante criterios canónicos, incluida la presencia de CTCF y proteínas del complejo cohesina, que son el sello distintivo de los límites TAD que se conservan en todos los tipos de células en especies estrechamente relacionadas (refs. 13,15,16). ,17,18,19; ver “Métodos” para más detalles). Estas eliminaciones variaron en tamaño de 11 a 80 kb y eliminaron todos los sitios de unión conocidos de CTCF y cohesina en cada región límite de TAD, dejando intactos los genes codificadores de proteínas cercanos (Fig. 1, Fig. 1 complementaria, Datos complementarios 3, “Métodos ”). Para los ocho límites, se obtuvieron con éxito ratones fundadores vivos heterocigotos para la eliminación específica y se criaron en líneas estables para evaluar los fenotipos moleculares y orgánicos.

Esquema que muestra la selección y la estrategia de eliminación basada en CRISPR/Cas9 para eliminar los límites de TAD in vivo, junto con los tipos de fenotipado realizados en los ratones knockout (KO) resultantes. También se representan límites específicos eliminados individualmente, junto con genes seleccionados expresados en el desarrollo que flanquean cada límite eliminado. Elemento límite B, factores de transcripción TF.

Para investigar las consecuencias in vivo de las eliminaciones de límites de TAD, evaluamos la viabilidad de todas las líneas en descendencia homocigótica (Fig. 2a, Datos complementarios 4). Primero, cruzamos ratones con deleción heterocigota para determinar si la descendencia homocigota era viable y estaba presente en la tasa esperada por Mendel (25%). Para la línea B1, en la que se había eliminado un límite entre Smad3 y Smad6, no se observaron ratones homocigotos para la eliminación entre 329 cachorros nacidos vivos. La reproducción cronometrada reveló que los embriones homocigotos están presentes en el día embrionario 8.5 (E8.5) en la proporción mendeliana esperada, pero no en etapas posteriores de desarrollo (p <0.05, prueba de Chi-cuadrado, para todas las etapas examinadas E10.5 y posteriores; Fig. .2b, y Datos complementarios 4). Si bien no se observaron embriones nulos homocigotos viables en E10.5, observamos embriones con deleción homocigota parcialmente reabsorbidos en esta etapa, lo que corrobora aún más que la deleción homocigota del límite B1 causa una pérdida de viabilidad completamente penetrante entre E8.5 y E10.5 (Fig. 2c, y “Métodos”). Las eliminaciones homocigotas de cuatro loci límite adicionales se asociaron con letalidad embrionaria o perinatal parcialmente penetrante (Fig. 2a). Para el caso más extremo (B2), observamos una pérdida de ~65% de la descendencia homocigótica esperada en el momento del destete (p = 3,90E–10, prueba de Chi-cuadrado; Fig. 2a, Fig. 2 complementaria). Para tres eliminaciones de límites adicionales (B3, B4, B5), observamos un agotamiento de homocigotos del 20 al 37% en el momento del destete (p <0,05, prueba de Chi-cuadrado, en todos los casos, Fig. 2a, Fig. complementaria 2). No hubo sesgos sexuales significativos entre la descendencia homocigótica viable en ninguna de las líneas (Figura complementaria 3 y Datos complementarios 4). En general, estos datos muestran que la mayoría (5 de 8, 63%) de los elementos límite probados son necesarios para la viabilidad normal del organismo.

una segregación mendeliana de crías de cruces heterocigotos al destete para todas las líneas de eliminación de límites TAD. P21 día posnatal 21, N número de crías analizadas, Hom homocigoto, Het heterocigoto, WT de tipo salvaje. b Segregación mendeliana de descendencia de cruces heterocigotos en etapas embrionarias designadas para el locus B1 de eliminación de límites (*p <0,05). E día embrionario, N número de embriones analizados. c Imágenes de campo claro de embriones mutantes homocigotos y de tipo salvaje de compañeros de camada representativos obtenidos en E10.5. Barra de escala, 1 mm.

Para evaluar los efectos de las eliminaciones de los límites de TAD en el panorama de interacción de la cromatina, realizamos una captura de conformación cromosómica de alto rendimiento (es decir, Hi-C) utilizando tejido de ratones adultos con eliminaciones homocigotas de los límites de TAD B2-B8 o eliminación heterocigota del límite B1. ya que la eliminación homocigótica de B1 es embrionariamente letal (Fig. 3, Fig. 4 complementaria y "Métodos"). Para cuatro loci, observamos que los ratones homocigotos nulos mostraban pérdida de aislamiento en los límites de TAD y fusión simultánea de TAD vecinos (loci B1-B3 y B6; Fig. 3, Fig. 4 complementaria). También se observó pérdida de aislamiento en una cuarta eliminación del límite de TAD (B8), pero esto no se asoció con cambios importantes en la configuración general de TAD en este lugar (Figura 4 complementaria). Como segunda medida de la estructura alterada de la cromatina, comparamos el índice de direccionalidad (DI) entre ratones knockout y controles de tipo salvaje. DI evalúa la tendencia de los contactos ascendentes (hacia la izquierda o negativos) o descendentes (hacia la derecha o positivos) a lo largo de una región del cromosoma5 y las regiones de las esquinas periféricas a los TAD donde se observan cambios abruptos en los contactos ascendentes y descendentes (es decir, sitios con sesgos de contacto estadísticamente significativos). se denominan computacionalmente límites entre TAD flanqueantes). Se observaron cambios en DI en mutantes homocigotos nulos en 6 de las 8 líneas evaluadas por Hi-C (p ≤ 0,01, prueba de suma de rangos de Wilcoxon, para los loci B1–4, B6 y B8; Fig. 3, Fig. Suplementaria. 4). Además, para tres eliminaciones de límites de TAD (loci B4, B7 y B8) observamos una reducción de los contactos de largo alcance en uno de los TAD adyacentes al límite eliminado (Figura 4 complementaria). En conjunto, observamos cambios en la conformación de la cromatina en el 88% (7 de 8) de las líneas examinadas. Estos datos indican que la eliminación de secuencias límite de TAD individuales afecta el aislamiento entre TAD vecinos, lo que resulta en una frecuencia de interacción alterada entre secuencias en dominios normalmente aislados.

Mapas de interacción derivados de Hi-C para los loci de límite TAD B1 (a), B2 (b) y B6 (c). Caricatura del límite de TAD eliminado, con genes de desarrollo seleccionados dentro de los TAD que flanquean el límite eliminado (B), seguido de tres mapas de calor que muestran datos de contacto Hi-C. Los mapas de calor (código de color amarillo-azul) muestran matrices de contacto Hi-C presentadas como contactos observados/esperados con una resolución de 25 kb en muestras representativas de tejido de hígado de ratón de tipo salvaje (WT) y knockout (KO). Para el locus B1 del límite TAD, tenga en cuenta que WT representa el alelo de tipo salvaje en el fondo Cast y KO representa el alelo de eliminación en el fondo FVB de un animal heterocigoto para la eliminación del límite TAD. El tercer mapa de calor (código de color rojo-azul) muestra cambios netos en las frecuencias de interacción Hi-C en el KO en relación con el WT. Las posiciones de los genes dentro del locus correspondiente se indican a lo largo del mapa de calor. La línea vertical discontinua de color naranja indica la posición del límite eliminado. Se muestran los perfiles de aislamiento para las muestras WT y KO correspondientes a los mapas de calor. El perfil de aislamiento asigna una puntuación de aislamiento a cada intervalo genómico50, donde los mínimos locales representan la región más aislada. Observe la desviación de los mínimos en el perfil de aislamiento para el KO en comparación con WT (cuadro naranja), lo que indica una pérdida de aislamiento en el KO. Los gráficos de barras muestran el índice de direccionalidad (DI)5 para las mismas muestras. Los límites se denominan regiones donde se observan cambios abruptos y significativos en los contactos aguas arriba y aguas abajo, como se muestra en el WT (cuadro negro). Tenga en cuenta la ganancia de contactos o la pérdida de demarcación entre los contactos ascendentes y descendentes en el sitio eliminado en el KO (cuadro rojo). Las coordenadas del genoma que se muestran están en mm10. En la Figura complementaria 4 y en "Métodos" se proporcionan más detalles sobre los antecedentes de la cepa de ratón, cuando corresponda, las réplicas y las eliminaciones de límites de TAD adicionales.

A continuación, examinamos si la pérdida de los límites de TAD y los cambios resultantes en la arquitectura de la cromatina se asociaban con fenotipos moleculares o fisiológicos adicionales. Para determinar si las eliminaciones alteraron la expresión de genes en las proximidades de cada límite TAD, medimos la expresión génica en embriones E11.5 con eliminaciones de límites homocigotos y controles de tipo salvaje emparejados. Para cada línea, se realizó RNA-seq en dos tejidos diferentes con expresión conocida de los genes ubicados en los TAD adyacentes, y se realizó qPCR para consultar genes seleccionados en un panel más grande de tejidos para un subconjunto de las líneas de eliminación de límites de TAD (suplementario Fig. 5-6 y datos complementarios 5-6). En las siete líneas examinadas por este enfoque, identificamos dos casos en los que cambió la expresión de un gen en un TAD que flanquea el límite. Los embriones homocigotos nulos para B2 mostraron una reducción del 44% en Tbx5 en los pulmones en comparación con los controles WT (padj = 0,04, figuras complementarias 5-6, datos complementarios 5-6). La regulación negativa de Tbx5 en embriones homocigotos nulos para B2 se corroboró aún más mediante la evaluación de la expresión de Tbx5 mediante hibridación in situ en la etapa E11.5 (Figura complementaria 7). Los embriones homocigotos nulos para B6 mostraron una reducción de ~40% en la expresión de tres genes (Meox2, Sostdc1 y Prkar2b en el corazón; Meox2 en la cara en desarrollo; padj = 0,04, figura complementaria 5 y datos complementarios 5). Si bien se muestrean solo un subconjunto de tejidos en un único momento del desarrollo, estos datos indican que la eliminación de los límites de TAD por sí sola puede provocar cambios pronunciados en la expresión genética específica del tejido.

Dado que la mayoría de las eliminaciones de los límites de TAD no dieron como resultado una letalidad embrionaria completamente penetrante, evaluamos los fenotipos posnatales en líneas con descendencia homocigótica viable (Fig. 4). En las evaluaciones iniciales de anatomía, morfología e histología generales, el fenotipo más notable observado ocurrió en ratones homocigotos para las eliminaciones del límite B2, ubicado entre Tbx5 y Lhx5, que muestran una viabilidad significativamente reducida (Fig. 2a). Los ratones knockout supervivientes mostraron pulmones muy subdesarrollados, con un pulmón izquierdo vestigial (Fig. 4b). Este fenotipo es parcialmente penetrante (12 de 20 ratones, o 60%) con tasas más altas observadas en mutantes homocigotos machos (82%) que en hembras (33%). Esta anomalía pulmonar es consistente con la regulación negativa del gen Tbx5 cercano en los pulmones en desarrollo, ya que el fenotipo se ha observado en inactivaciones pulmonares específicas de Tbx533. Un examen más detenido del límite B2 reveló que una subregión de la región eliminada muestra una firma potenciadora específica del pulmón en el atlas epigenómico ENCODE de secuencias reguladoras34,35 (Figura complementaria 8a). Probamos esta región de subregión de 852 pb en un ensayo de indicador de ratón transgénico y observamos que era suficiente para impulsar la expresión del gen indicador en los pulmones en desarrollo a lo largo de múltiples etapas embrionarias de ratón. (Figura complementaria 8b y “Métodos”). Sin embargo, ni la eliminación dirigida de la secuencia potenciadora de forma aislada ni la eliminación del potenciador junto con un sitio de unión CTCF inmediatamente adyacente dieron como resultado los fenotipos pulmonares observados tras la eliminación de la región límite B2 completa (Figura 9 complementaria), lo que indica que la pérdida de el potenciador pulmonar incrustado en la región límite no es la causa principal del fenotipo pulmonar observado.

a Descripción general de la evaluación fenotípica integral realizada para caracterizar los efectos de la eliminación de los límites de TAD in vivo. b Los mutantes homocigotos (KO) para el locus B2 de eliminación de límites de TAD muestran un pulmón izquierdo vestigial. Barra de escala, 5 mm.

Se seleccionó un subconjunto de las líneas restantes (B3, B5, B6, B7) para un fenotipado completo basado en parámetros definidos por el Consorcio Internacional de Fenotipado de Ratones (IMPC)36,37,38. Los ensayos incluyeron un panel estandarizado de exámenes anatómicos, histológicos y de necropsia generales, que incluyeron 230 pruebas sensoriales, neurológicas y de comportamiento, 20 pruebas que miden la función cardíaca, 35 pruebas de función metabólica, 20 parámetros hematológicos/inmunológicos y 36 pruebas musculoesqueléticas, realizadas en 7 a 12 pares de ratones knockout homocigotos y de control del mismo sexo y edad de cada línea (> 6000 puntos de datos en 350 mediciones totales; Fig. 4a, Fig. 10 complementaria y Datos complementarios 7). Estos esfuerzos sistemáticos de fenotipado identificaron 30 parámetros adicionales con desviaciones individualmente significativas de los controles de tipo salvaje (Datos complementarios 7). Sin embargo, debido al tamaño limitado de la muestra y al gran número de parámetros evaluados, estas observaciones iniciales generalmente no son significativas después de la corrección para pruebas de hipótesis múltiples. Sin embargo, junto con los fenotipos de viabilidad, cromatina y expresión observados de forma independiente en estas líneas, estos datos proporcionan pistas para una caracterización más profunda.

Se ha planteado la hipótesis de que los límites de TAD son críticos para la función normal del genoma en función de sus funciones moleculares conocidas en la definición de territorios reguladores a lo largo de los cromosomas y en la prevención de interacciones potenciador-promotor entre dominios de cromatina adyacentes. Esta idea fue respaldada por observaciones de fenotipos de enfermedades asociados con mutaciones estructurales que incluyen límites TAD, aunque en la mayoría de los casos en combinación con características genómicas adyacentes, como secuencias reguladoras o genes codificadores de proteínas2,8,39,40. Para evaluar sus requisitos generales para el genoma normal y la función del organismo, realizamos eliminaciones genómicas específicas de ocho límites TAD en ratones, utilizando las características canónicas de los límites TAD basadas en firmas moleculares (ubicación entre TAD; CTCF y sitios de unión de cohesina) para seleccionar el extremo. puntos de cada eliminación. Nos centramos en regiones del genoma que incluían genes con funciones de desarrollo conocidas para facilitar la detección de posibles fenotipos. Sorprendentemente, las ocho eliminaciones de límites de TAD dieron como resultado fenotipos moleculares u organizacionales anormales (resumidos en la Fig. 5). Esto incluyó siete líneas que mostraban alteraciones en las interacciones de la cromatina dentro o entre TAD vecinos, dos líneas con alteraciones sustanciales del nivel de expresión de genes vecinos, cinco líneas que mostraban letalidad embrionaria total o parcial y una línea que mostraba defectos en el desarrollo pulmonar.

Las columnas muestran límites de TAD específicos (B1-8) eliminados en este estudio, genes de desarrollo clave dentro de los TAD flanqueantes (Genei-1 y Genei+1), tamaños aproximados de eliminación de límites (Deletioni) y el número de supuestos grupos de CTCF eliminados. Todos los datos de las columnas siguientes son resúmenes de información fenotípica de ratones homocigotos para las respectivas eliminaciones de límites TAD. Estos incluyen efectos sobre la viabilidad (totalmente letal en la cruz roja, subviable mostrado en una flecha roja o amarilla para indicar la magnitud del efecto, sin desviación de las proporciones mendelianas esperadas mostradas en las marcas verdes), fertilidad de animales homocigotos machos y hembras (al menos Se evaluó la aptitud reproductiva de tres machos homocigotos y tres hembras homocigotas (las marcas de verificación verdes indican animales fértiles) y se observaron fenotipos fisiológicos manifiestos. La columna para el cambio de cromatina indica la presencia de cambios DI significativos y/o alteraciones significativas en las frecuencias de contacto de la cromatina intradominio en los TAD flanqueantes, evaluados por Hi-C. La última columna indica si se observaron cambios de expresión significativos para los genes cercanos al límite TAD eliminado. No aplicable y no determinado.

De las siete eliminaciones de límites de TAD que mostraron alteraciones en las interacciones de la cromatina, cuatro dieron como resultado la fusión de los TAD vecinos en las respectivas líneas de eliminación (B1–3, B6), lo que indica una alteración grave de la función de límites. En los casos restantes, los TAD adyacentes permanecieron intactos en general a pesar de haber eliminado la región límite del TAD según lo definido por las características canónicas del TAD. Esto implica que los enfoques actuales para definir los límites exteriores de los elementos límite del dominio pueden ser imperfectos y que determinantes locales adicionales pueden desempeñar funciones instructivas en la formación y el mantenimiento del dominio de cromatina. Curiosamente, observamos una viabilidad reducida en dos líneas (B4, B5) en ausencia de TAD fusionados, lo que sugiere impactos funcionales de la eliminación de límites que son independientes de la fusión de dominios vecinos. Esto está bien alineado con la noción de que incluso cambios sutiles en la estructura tridimensional de la cromatina pueden resultar en cambios sustanciales en la expresión genética local41. Nuestros resultados apuntan a impactos regulatorios u otros impactos funcionales de la eliminación de límites que ocurren en ausencia de la fusión completa de los dominios vecinos. Por ejemplo, la pérdida del límite B4 no da como resultado la fusión de dominios, pero sí conduce a una disminución de la viabilidad del organismo, lo que presumiblemente resulta de cambios sutiles en la estructura de la cromatina y los mecanismos reguladores posteriores.

Concomitantemente con los cambios en la conformación de la cromatina, observamos cambios en la expresión génica para tejidos específicos en el momento examinado para dos (B2 y B6) de los siete loci límite TAD. Para la deleción B6, los genes con expresión alterada (Meox2, Sostdc1, Prkar2b) se encuentran en regiones sin cambios significativos en el contexto tridimensional en comparación con la configuración de tipo salvaje. Una posible explicación es que no se detectaron cambios más sutiles en las subtopologías anidadas dentro de los TAD flanqueantes en la resolución de nuestros datos de conformación, pero son suficientes para interrumpir las interacciones entre los elementos reguladores y los promotores de genes sensibles a la dosis42,43.

Para ratones con una eliminación homocigótica del límite B1, se observó letalidad embrionaria totalmente penetrante. Si bien en este estudio no se evaluó el proceso de desarrollo exacto afectado, este resultado demuestra un papel crítico de este límite para la viabilidad y el desarrollo normal. La deleción del límite B2 causó una malformación pulmonar pronunciada que recapitula un fenotipo asociado con la deleción específica del pulmón del gen cercano Tbx533. Curiosamente, este límite contiene un potenciador del desarrollo pulmonar en las inmediaciones de un importante sitio de unión de CTCF, pero ni la eliminación del potenciador, ni la eliminación del sitio CTCF, ni la eliminación de estas dos pequeñas subregiones en combinación recapitulan el fenotipo observado tras la eliminación del completar la región límite B2. Esta observación refuerza la posibilidad de que funciones moleculares críticas estén incrustadas a lo largo de la región límite extendida de TAD, lo que puede incluir la presencia de elementos potenciadores pulmonares adicionales y funcionalmente redundantes44 que se ven afectados por la eliminación de B2. Nuestros hallazgos resaltan la necesidad de una mejor comprensión de las delimitaciones espaciales de las regiones límite dentro del genoma. Para los loci límite de TAD donde observamos desviaciones de la viabilidad normal pero no identificamos otros fenotipos fisiológicos obvios (B3-5), los mecanismos moleculares subyacentes a los fenotipos de supervivencia aún no se han establecido. Si bien realizamos una encuesta razonablemente completa para evaluar la posible expresión genética y fenotipos del organismo, no podemos excluir la presencia de expresión genética adicional u otros cambios fenotípicos que se manifiestan en el momento del desarrollo o en un tejido o condición ambiental distinta de los examinados. Tampoco podemos excluir la presencia de fenotipos muy sutiles, por ejemplo cambios en el momento del desarrollo.

Las eliminaciones de límites realizadas en este estudio provocaron un espectro de fenotipos, que van desde graves (letalidad embrionaria completa) hasta leves (fenotipos moleculares únicamente). Del mismo modo, los límites elegidos variaron ampliamente en el número de grupos de CTCF presentes, desde dos en los límites que causaron interacciones alteradas de la cromatina o cambios en la expresión genética únicamente, hasta tres a cinco en los límites que causaron una viabilidad reducida, hasta 11 grupos de CTCF en el límite que causó el fenotipo más severo. Se sabe que la dosis de CTCF en los límites de TAD afecta la formación de TAD22,45,46, y si bien el número de límites estudiados aquí es demasiado pequeño para establecer una correlación estadísticamente sólida, es tentador especular que las eliminaciones de límites con más CTCF Los sitios tienden a causar fenotipos más pronunciados.

Nuestros hallazgos tienen implicaciones importantes para la interpretación de los datos de secuenciación del genoma humano completo en entornos genéticos clínicos. Los efectos de posición resultantes de grandes variaciones estructurales son bien conocidos en genética humana47, pero a menudo es difícil desconectar tales deleciones y/o reordenamientos de secuencias funcionales, como genes codificadores de proteínas y potenciadores, de los efectos que se deben a la eliminación de secuencias límite. Sorprendentemente, ninguna de las ocho regiones eliminadas del genoma del ratón en este estudio se elimina por completo en ~760.000 genomas humanos disponibles, lo que coincide con su importancia funcional (gnomAD-SV v2.148 y rCNV249). Un objetivo futuro fundamental será determinar la relación entre las mutaciones humanas dentro de los miles de límites TAD de todo el genoma y su impacto en la variación fenotípica humana y las enfermedades. El presente estudio indica que la eliminación de las secuencias límite de TAD relativamente pequeñas causa fenotipos moleculares u organizacionales y, por lo tanto, las variantes estructurales que incluyen eliminaciones de límites TAD en pacientes humanos deben considerarse como causas potenciales de patogenicidad.

Los datos de captura de conformación cromosómica publicados anteriormente se utilizaron para análisis combinados y selección de loci de eliminación de límites de TAD en este estudio, en el que las llamadas de límites de TAD se basaron en el enriquecimiento máximo de CTCF en los bordes de TAD y su consistencia entre los tipos de células10. Luego se clasificaron más de 3300 límites TAD anotados en todo el genoma5,10 según una puntuación ponderada (consulte la figura complementaria 1), que abarca la resistencia del aislamiento en función de la ocupación del factor de unión de CCCTC (CTCF), la coocupación de subunidades del complejo de cohesina y el factor de transcripción Znf14331 y la conservación de unión a CTCF en regiones ortólogas en cuatro especies de mamíferos diferentes (Fig. 1, Fig. 1 complementaria). Analizamos ~ 100 conjuntos de datos ChIP-seq individuales a este efecto (enumerados en Datos complementarios 1). Los sitios unidos a CTCF en todo el genoma se agruparon espacialmente y se calificaron individualmente según los criterios resaltados anteriormente dentro de las regiones de 40 kb aguas arriba y aguas abajo de cada límite TAD. Se ideó una puntuación general para cada límite en función de los CTCF unidos intervinientes, excluyendo los límites que se superponen a los genes codificadores de proteínas, lo que permite una interpretación inequívoca de la necesidad funcional de los límites TAD en el desarrollo de los mamíferos. Además, se priorizaron para la eliminación in vivo los límites donde los TAD flanqueantes albergaban genes que codificaban factores de transcripción importantes para el desarrollo y preferentemente (en la medida de lo posible) que mostraban un patrón divergente de expresión específica de tejido. Nuestros criterios de selección no tuvieron en cuenta la direccionalidad de los motivos CTCF al seleccionar los loci límite de TAD para su eliminación (Figura 1 complementaria).

Todo el trabajo con animales fue revisado y aprobado por el Comité Nacional de Bienestar Animal del Laboratorio Lawrence Berkeley. Los ratones fueron monitoreados diariamente para determinar la ingesta de alimentos y agua, y los animales fueron inspeccionados semanalmente por el presidente del Comité de Investigación y Bienestar Animal y el jefe de la instalación para animales en consulta con el personal veterinario. El LBNL ACF está acreditado por la Asociación Estadounidense para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Se realizaron eliminaciones de límites de TAD en ratones de cepa Mus musculus FVB con una excepción para el límite B1 de TAD, donde fue necesario generar ratones heterocigotos nulos en un entorno de cepa mixta (Cast/Eij y FVB) específicamente para realizar los ensayos de Hi-C. En este estudio se utilizaron ratones en todas las etapas de desarrollo desde el día embrionario 10,5 hasta P0, así como ratones entre las semanas 4 y 16. En el análisis se utilizaron animales de ambos sexos. Las estrategias de selección del tamaño de la muestra y aleatorización se incluyen en secciones de métodos individuales. A menos que se indique lo contrario, todos los ratones fenotipados descritos en el artículo resultaron del cruce de ratones heterocigotos con eliminación de límites TAD para permitir la comparación de compañeros de camada coincidentes de diferentes genotipos. Las muestras se diseccionaron y procesaron ciegamente al genotipo cuando correspondía.

Se generaron ratones transgénicos utilizando la cepa Mus musculus FVB y un protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 estándar50. Brevemente, la proteína Cas9 (número de catálogo de Integrated DNA Technologies 1081058) en una concentración final de 20 ng/μl se mezcló con sgRNA dirigido al locus deseado (50 ng/μl, para todos los sgRNA combinados), en tampón de microinyección (Tris 10 mM, pH 7,5; EDTA 0,1 mM). La mezcla se inyectó en los pronúcleos de embriones FVB fertilizados en etapa unicelular obtenidos de los oviductos de hembras FVB superovuladas de 7 a 8 semanas de edad apareadas con machos FVB (ver Datos complementarios 8 para secuencias de sgRNA). Luego, los embriones inyectados se cultivaron en medio M16 suplementado con aminoácidos a 37 °C bajo 5% de CO2 durante aproximadamente 2 h. Posteriormente, los embriones se transfirieron al útero de madres sustitutas CD-1 pseudoembarazadas. Se genotiparon los ratones fundadores (F0) mediante PCR con polimerasa Taq platino de alta fidelidad (Thermo Fisher) para identificar aquellos con los puntos de interrupción de eliminación generados por NHEJ deseados. Se utilizó la secuenciación de Sanger para identificar y confirmar puntos de interrupción de eliminación en ratones F0 y F1 (Fig. 11 complementaria, Datos complementarios 8 para plantillas de sgRNA de CRISPR y Datos complementarios 9 para secuencias de cebadores y amplicones de PCR). Se obtuvieron entre uno y cuatro fundadores F0 para cada uno de los loci de eliminación del límite TAD, cada uno de los cuales se analizó simultáneamente para detectar posibles inversiones mediante PCR. Sólo aquellos fundadores F0 que albergaban alelos de deleción limpios se retrocruzaron con ratones de tipo salvaje y se criaron para obtener ratones heterocigotos F1. Dado que cada una de las eliminaciones entre los fundadores fue consistente en el período de eliminación mediado por NHEJ, finalmente se seleccionó solo una línea fundadora para cada locus para expandir el mejoramiento para los experimentos en este documento. La confirmación y visualización adicionales de los límites de TAD eliminados son evidentes en las matrices de contacto Hi-C resultantes de experimentos de Hi-C en tejido de mutantes de límites TAD homocigotos en comparación con ratones de tipo salvaje (Figura complementaria 11).

La generación de ratones con deleción para secuencias reguladoras seleccionadas dentro del límite B2 de TAD abarcó eliminaciones individuales de un potenciador pulmonar (potenciador Δ), un sitio CTCF adyacente (CTCF Δ) y la eliminación del potenciador junto con el sitio CTCF (potenciador+CTCF Δ) como control. . Estos ratones se generaron de manera idéntica a los métodos descritos anteriormente y se proporcionan detalles en consecuencia (Fig. 12 complementaria, Datos complementarios 8 para plantillas de sgRNA de CRISPR y Datos complementarios 9 para secuencias de cebadores y amplicones de PCR).

Además, se utilizaron ratones heterocigotos para el límite B1 de TAD para realizar ensayos de Hi-C para esta línea de desactivación del límite de TAD. Sin embargo, para evitar el problema de distinguir los alelos bioinformáticamente, se necesitaron ratones con un fondo de tinción mixta para evaluar los cambios en los contactos Hi-C tras la eliminación de los límites. Con este fin, obtuvimos ratones Cast/Eij de tipo salvaje del Laboratorio Jackson y los cruzamos con nuestros ratones FVB existentes que eran heterocigotos para la eliminación B1 del límite TAD. Los ratones heterocigotos resultantes de estos cruces dieron como resultado animales heterocigotos de límite B1 TAD que albergaban un fondo Cast/Eij para el alelo de tipo salvaje y un fondo FVB concomitante para el alelo de deleción.

Las líneas de ratones descritas están disponibles a través del Mutant Mouse Resource and Research Center, www.mmrrc.org, y se pueden encontrar en el catálogo del MMRRC utilizando el símbolo de la región reguladora o los Identificadores de recursos de investigación (RRID) (Datos complementarios 10).

Los tamaños de muestra se seleccionaron empíricamente en base a nuestros estudios previos44,51. La segregación mendeliana se evaluó inicialmente postnatalmente en animales resultantes de cruces heterocigotos, permitiendo así la comparación de compañeros de camada coincidentes de diferentes genotipos. Cuando correspondía, las proporciones mendelianas se evaluaron en puntos de tiempo embriológicos según lo requiera el fenotipo caso por caso. Para el límite B1 de TAD, aunque rara vez hemos obtenido mutantes homocigotos nulos en E13.5, no se observaron embriones homocigotos nulos viables en E10.5 en una evaluación sistemática de la segregación mendeliana en 213 muestras embrionarias recolectadas entre los días embrionarios 8,5-15,5 para esta línea eliminatoria (Datos complementarios 4).

Se realizaron experimentos de Hi-C en tejido hepático ex vivo de ratones macho en el día 56 postnatal. Tras la eutanasia, se recolectaron muestras de hígado, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se pulverizaron antes de la reticulación con formaldehído al 1% durante 15 minutos. El tejido reticulado descongelado se disoció mediante un disociador de tejidos MACS suave utilizando el programa configurado de fábrica y se filtró a través de un filtro de células BD de 40 µm. Los sedimentos celulares se centrifugaron a 1000 x g durante 6 minutos a 4 ° C y se cubrieron con 3 ml de sacarosa 1 M. La suspensión se centrifugó a 2500 x g durante 6 min a 4 °C. Los núcleos granulados se resuspendieron en 50 μl de SDS al 0,5% y se incubaron durante 10 minutos a 62 °C. El SDS se inactivó añadiendo Triton X-100 e incubando durante 15 minutos a 37 °C. La cromatina se digirió usando MboI (100 U; NEB) a 37 °C durante la noche con agitación (1000 rpm). La enzima se inactivó calentando durante 20 minutos a 62 °C. Los extremos fragmentados se marcaron con biotina-14-dATP (Life Technologies) usando ADN polimerasa Klenow (0,8 U μl-1; NEB) durante 60 min a 37 °C con rotación (900 rpm). Posteriormente, los extremos se ligaron durante 4 h a temperatura ambiente utilizando ADN ligasa T4 (4000 unidades; NEB). La reticulación inversa se realizó utilizando Proteinasa K (1 mg, NEB) e incubación a 55 °C durante la noche. La eficiencia de la digestión y la eficiencia de la ligación se comprobaron mediante electroforesis en gel. A continuación, el ADN se purificó mediante precipitación con etanol y se cortó utilizando un ultrasonido enfocado Covaris (M220; ciclo de trabajo: 10 %; potencia: 50, ciclos/ráfaga: 200, tiempo: 70 s). Después de la selección del tamaño y la purificación usando perlas SPRI (Beckman Coulter), el ADN se extrajo con biotina usando perlas Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Life Technologies). Finalmente, se prepararon bibliotecas de secuenciación en perlas magnéticas T1 y se realizó la amplificación final por PCR durante siete ciclos según el análisis de qPCR. Las bibliotecas purificadas con perlas se cuantificaron con un Qubit y luego se diluyeron para evaluar la distribución de tamaño utilizando High Sensitivity D1000 ScreenTape en una TapeStation (Agilent).

Hi-C se realizó en dos réplicas biológicas cada una para muestras homocigotas nulas y de control para cada uno de los loci B2-8 de eliminación del límite TAD. Para el límite B1 de TAD, se realizó Hi-C en dos réplicas biológicas que eran heterocigotas nulas para la eliminación del límite y una muestra de tipo salvaje, y todas estas muestras se generaron a partir de ratones de fondo de cepa mixta (Cast/FVB) para lo siguiente razones (i) la letalidad embrionaria temprana de los mutantes homocigotos para esta línea de ratón, (ii) el requisito de una gran cantidad de tejido para realizar experimentos de Hi-C, (iii) las limitaciones del uso de mutantes heterocigotos en un fondo de FVB isogénico para experimentos de Hi-C , ya que esto haría que los análisis posteriores específicos de alelos fueran problemáticos. Los detalles sobre la generación de estos ratones se describen en "Métodos".

El canal de procesamiento de datos Hi-C está disponible en https://github.com/ren-lab/hic-pipeline. Brevemente, con respecto a los loci límite de TAD B2–8, las lecturas de Hi-C se alinearon con el genoma de referencia mm10 del ratón utilizando BWA-MEM52 para cada lectura por separado y luego se emparejaron. Para el locus límite B1 de TAD, donde se usó tejido de animales en un entorno de cepa mixta, construimos secuencias del genoma Cast y FVB usando la información SNP, luego usamos BWA-MEM46 para alinear las lecturas sin procesar con la secuencia del genoma Cast y FVB; A continuación, para cada lectura, comparamos las dos cualidades del mapeo y la longitud del mapeo, elegimos los resultados del mapeo con puntuaciones más altas. Más allá de este paso de análisis, los análisis posteriores para todos los loci límite de TAD siguieron los mismos estándares. Para lecturas quiméricas, solo se mantuvieron las ubicaciones asignadas en el extremo 5'. Los pares de lectura duplicados asignados a la misma ubicación se eliminaron para dejar solo un par de lectura único (MarkDuplicates en el paquete Picard). Los archivos bam de salida se transformaron al formato de archivo exprimidor para su visualización en Juicebox53,54. Las matrices de contactos se presentaron como contactos observados/esperados con una resolución de 25 kb y se normalizaron utilizando el método de equilibrio de matrices de Knight-Ruiz55. El índice de direccionalidad para cada muestra también se generó con una resolución de 25 kb5. La puntuación de aislamiento para cada muestra se generó con una resolución de 25 kb con un cuadrado de 500 kb56. Para los datos de la Fig. 3, se promediaron las puntuaciones del índice de direccionalidad (DI) de cinco contenedores a la derecha y cinco contenedores a la izquierda, antes de calcular la diferencia. Una puntuación delta DI más alta indica un límite más fuerte. Se realizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon entre muestras KO y WT utilizando puntuaciones delta DI, y un valor de p ≤ 0,05 se consideró significativo. Como control negativo, se realizó la misma prueba estadística en ~2900 límites de TAD que no se superponen con las eliminaciones, y las diferencias entre las muestras WT y KO se evaluaron mediante la misma prueba estadística, utilizando un umbral de significancia de p ≤ 0,05.

No observamos ningún otro límite en todo el genoma que mostrara una diferencia significativa en la puntuación DI delta que excediera la de los límites eliminados B2, B3, B4, B6 y B8, para los cuales habíamos observado cambios significativos en la puntuación DI delta. Doce límites (0,4%) en todo el genoma mostraron cambios que fueron significativos (p ≤ 0,05) y cuantitativamente iguales o excedieron los observados en los límites B5 y B7 de TAD eliminados, para los cuales no observamos cambios significativos en la puntuación DI delta (p > 0,05: Fig. 3 y Fig. complementaria 4. Las frecuencias de interacción entre loci genómicos se visualizaron adicionalmente en Juicebox (Fig. complementaria 4) 53,54.

Se recopiló de manera estandarizada un panel de tejidos que incluye el cerebro anterior, el cerebro medio, el cerebro posterior, la cara, el corazón, las extremidades superiores e inferiores y el tubo neural de manera estandarizada en E11.5 de mutantes homocigotos, así como de embriones de tipo salvaje compañeros de camada para cada una de las deleciones de límites de TAD. loci34. Las muestras se suspendieron en 100 µl de tampón RLT disponible comercialmente (Qiagen). Los ARN totales se aislaron utilizando el mini kit Qiagen RNeasy (n.º de catálogo 74104). Se seleccionó además un conjunto de dos tipos de tejido relevantes para cada uno de los loci B2-B8 de eliminación del límite TAD y se procesó para bibliotecas de RNA-seq de manera estandarizada. Novogene preparó bibliotecas de secuenciación y las secuenciaron en un Illumina NovaSeq6000 (150 pb, extremos emparejados). Los datos de RNA-seq se analizaron utilizando ENCODE Uniform Processing Pipelines (//www.encodeproject.org/pipelines/) implementados en DNAnexus (//www.dnanexus.com). Utilizando la tubería ENCODE RNA-seq (larga): 1 tubería replicada (de un solo extremo) (código disponible en https://github.com/ENCODE-DCC/rna-seq-pipeline), las lecturas se asignaron al genoma del ratón ( mm10) usando alineación STAR (V2.12). Se generaron gráficos de cobertura de todo el genoma utilizando bam to señales (v2.2.1). Se generaron recuentos de expresión génica para las anotaciones del gen gencode M4 utilizando RSEM (v1.4.1). Los análisis de expresión diferencial se realizaron utilizando el programa DESeq en el paquete estadístico R https://bioconductor.org/packages/3.3/bioc/vignettes/DESeq/inst/doc/DESeq.pdf57,58. Los genes expresados diferencialmente estadísticamente significativos para tejidos relevantes para cada locus de eliminación de límites TAD se enumeran en la Figura complementaria 5 y en los Datos complementarios 5. Los experimentos de secuencia de ARN se realizaron en dos réplicas biológicas cada una para mutantes homocigotos, así como controles de tipo salvaje.

El análisis cuantitativo por PCR de genes clave del desarrollo en las proximidades de cada límite TAD en un panel más grande de tejidos E11.5 no identificó ningún cambio significativo adicional en la expresión génica (Figura 6 complementaria y Datos complementarios 6). Para el panel completo de tejidos recolectados, se aisló ARN como se describe anteriormente y se sintetizó ADNc utilizando Omniscript RT (número de catálogo de Qiagen 205111) según los métodos estándar. Se realizaron ensayos de qPCR para al menos dos genes, cada uno en TAD que flanquea inmediatamente el límite eliminado. Se utilizaron reactivos del ensayo Taqman (Life Technologies) para todos los objetivos, incluidos los genes que se utilizaron para normalizar los niveles de expresión. Los ensayos Taqman (Roche Applied Science) con secuencias de cebadores específicos de genes se generaron utilizando el algoritmo en línea del fabricante y se enumeran en los Datos complementarios 11. Todos los amplicones abarcan uniones exón-exón para evitar la amplificación del ADN genómico. Se realizaron ensayos de 30 µl dispensados en la mezcla maestra TaqMan Universal PCR 2X (Applied Biosystems) en LightCycler 480 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los valores de Ct se comprobaron manualmente. Los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCT59 normalizado al gen de mantenimiento Actb, y la media de las muestras de control de tipo salvaje se estableció en 1. Se evaluaron al menos tres muestras mutantes independientes y controles de camada y de etapa coincidente para cada genotipo. /condición. No observamos cambios de expresión significativos cerca de los límites eliminados B3, B5 y B7. Teniendo en cuenta que el análisis de secuencia de ARN se realizó en tejido a granel desde un único momento del desarrollo, no podemos excluir que los cambios de expresión estén restringidos a subconjuntos de células presentes en estos tejidos o que puedan ser más pronunciados en otros momentos del desarrollo.

Para evaluar la expresión de Tbx5 en pulmones en desarrollo para el control y mutantes de deleción del límite TAD para el locus B2, se llevó a cabo una hibridación in situ de montaje completo utilizando sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina en un ratón E11.5 (etapa de 48 somitas). embriones siguiendo protocolos establecidos60,61. Las muestras fueron tratadas con Proteinasa K durante 15 min; Se diseccionaron embriones para extraer los corazones y exponer los pulmones y posteriormente se tomaron imágenes con un estereomicroscopio Leica 125 C con una cámara Flexacam C1 (Figura complementaria 7).

Los resultados directamente relevantes se resumen en la Fig. 4. Los mutantes y los controles de tipo salvaje para cuatro de los ocho loci de eliminación de límites de TAD (B3, B5, B6 y B7) se sometieron a un fenotipado completo utilizando una tubería estandarizada en el Programa de Biología del Ratón (MBP). Universidad de California, Davis. El proyecto es parte del Proyecto Knockout Mouse Phenotyping (KOMP2), financiado por los NIH, y que participa en el Consorcio Internacional de Fenotipado de Ratones (IMPC). Las pruebas de fenotipado se derivan del recurso internacional de fenotipado de ratones de pantallas estandarizadas (IMPReSS), https://www.mousephenotype.org/impress36; se puede acceder a todos los protocolos y metadatos en https://www.mousephenotype.org/impress/PipelineInfo. El fenotipado de KOMP2 (Figura 10 complementaria) y los métodos de análisis estadístico están estandarizados37,38. Los datos complementarios 7 resumen otros resultados estadísticamente significativos (p <0,005) informados. Se fenotiparon mutantes y controles de tipo salvaje para los otros tres loci de eliminación de límites de TAD (B2, B4 y B8) utilizando métodos estándar para necropsia macroscópica, pesos de órganos e histopatología para todos los principales sistemas de órganos en el Laboratorio de Patología Comparada de la Universidad de California, Davis. .

Los ensayos de potenciador-informador transgénico para el potenciador pulmonar previsto (852 pb) se realizaron en un ensayo de ratón transgénico dirigido al sitio utilizando un promotor Shh mínimo y un gen indicador lacZ (Figura complementaria 8) en un locus de puerto seguro no endógeno50. La región potenciadora predicha se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de ratón; chr5:120101603–120102454 (mm10), CTGGGCTACAGGAAGTTGGA (cebador directo), CAGAGGGCATGAGAGAGACC (cebador inverso), amplicón de PCR de 852 pb. El amplicón de PCR se clonó en un vector indicador lacZ (Addgene #139098) usando el ensamblaje Gibson (New England Biolabs)62. El vector transgénico final consiste en la secuencia potenciadora-promotor-informadora predicha, flanqueada por brazos de homología destinados a la integración específica del sitio en el locus H11 en el genoma del ratón50. La secuencia de las construcciones clonadas se confirmó con la secuenciación de Sanger y con MiSeq. Se generaron ratones transgénicos usando inyección pronuclear, como se describió anteriormente para generar ratones con eliminación de límites TAD. Se recogieron embriones F0 para teñirlos en E11.5, E14.5 y E16.5.

La tinción con β-galactosidasa se realizó de forma estandarizada50. Brevemente, los embriones se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X fría y se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 30 minutos para los embriones E11.5 y 60 minutos para los embriones E14.5 y E16.5, respectivamente, mientras se rodaban a temperatura ambiente. Los embriones se lavaron en tampón de lavado de embriones (cloruro de magnesio 2 mM [Ambion, n.º de catálogo AM9530], sustituto de NP-40 al 0,02 % [Fluka, n.º de catálogo 74385], desoxicolato al 0,01 % [Sigma-Aldrich, n.º de catálogo D6750] diluido en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,3) tres veces durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente y transferido a una solución de tinción X-gal recién preparada (ferricianuro de potasio 4 mM [Sigma-Aldrich, n.º de catálogo P3667], ferrocianuro de potasio 4 mM [ Sigma-Aldrich, nº de catálogo P9387], Tris 20 mM, pH 7,5 [Invitrogen, nº de catálogo 15567027], 1 mg ml-1 de X-gal [Sigma-Aldrich, nº de catálogo B4252]). Los embriones se incubaron en la solución de tinción durante la noche mientras se rodaban a temperatura ambiente y se protegían de la luz. Luego, los embriones se lavaron con 1 × PBS tres veces durante 30 a 60 minutos por lavado y posteriormente se almacenaron en PFA al 4% a 4 °C. Los embriones fueron genotipados para determinar la presencia de la construcción transgénica50. Sólo aquellos embriones positivos para la integración del transgén en el locus H11 y en la etapa de desarrollo correcta se consideraron para la actividad del gen informador comparativo en las tres construcciones probadas. El número exacto de embriones se informa en la figura complementaria 8.

Los análisis estadísticos se describen en detalle en los Métodos. Para las proporciones mendelianas, se recolectaron sistemáticamente entre 18 y 43 muestras embrionarias (locus límite B1 de TAD) y entre 101 y 343 (B1-8) de ratones en la etapa de destete, y se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para determinar desviaciones significativas. Se analizaron al menos dos muestras biológicas independientes por condición para RNA-seq, y al menos tres muestras biológicas independientes por condición se analizaron para qPCR en e11.5; Se utilizaron una prueba de índice de verosimilitud (DESeq) y una prueba t para determinar diferencias significativas en los resultados de RNA-seq y qPCR, respectivamente. Se analizaron al menos dos muestras biológicas independientes por condición para experimentos de Hi-C y se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para calcular los valores de p. Se evaluaron entre 7 y 12 ratones postnatales independientes por condición en el proceso estandarizado IMPC, y se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon, la prueba exacta de Fisher o las pruebas de modelo mixto PhenStat o de rango de referencia, según correspondiera. Para el límite B2 de TAD, se evaluaron 20 pares de control mutante homocigotos de estadio y camada para determinar la morfología pulmonar macroscópica. Se evaluaron entre 4 y 9 muestras biológicas independientes para los ensayos de indicadores transgénicos in vivo que mostraban actividad potenciadora en los pulmones embrionarios. Para las eliminaciones específicas de potenciador, CTCF y potenciador + CTCF en el contexto del límite B2 de TAD, se evaluó la morfología pulmonar macroscópica entre 3 y 8 ratones independientes por genotipo. Todas las estadísticas se estimaron y los gráficos se generaron utilizando el entorno informático estadístico R Versión 2022.12.0 + 353 (www.r-project.org).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de Hi-C y RNA-seq discutidos en esta publicación se han depositado en Gene Expression Omnibus63,64 del NCBI y se puede acceder a ellos a través del número de acceso de la serie GEO GSE172089. Los datos de origen para la Fig. 2 y la Fig. 3 complementaria se proporcionan en los Datos complementarios 4, los de la Fig. 5 complementaria se proporcionan en los Datos complementarios 5 y los de la Figura 6 complementaria se proporcionan en los Datos complementarios 6. Los datos de origen para la Fig. 3 complementaria se proporcionan en los Datos complementarios 6. Las Figuras 11 y 12 se proporcionan en las Figuras complementarias 13 y 14 respectivamente. Los autores correspondientes pueden obtener datos adicionales que respaldan los hallazgos de este estudio previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU. para LAP y AV (UM1HG009421). La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio Nacional EO Lawrence Berkeley y se realizó bajo el contrato DE-AC02-05CH11231 del Departamento de Energía de EE. UU., Universidad de California (UC). El fenotipado realizado por el Programa de Biología del Ratón (MBP) de UC Davis (www.mousebiology.org) fue financiado por un suplemento administrativo de los NIH a la subvención KOMP2, 3UM1OD023221-07S1, para el fenotipado de elementos no codificantes. Adyam Akeza recibió el apoyo de la subvención R25GM095401 del programa Bridges to Baccalaureate de los NIH a través de UC Berkeley. JL-R. cuenta con el apoyo del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (PID2020-113497GB-I00). Agradecemos a Renee Araiza y Louise Lanoue por su ayuda con la coordinación del trabajo y el análisis de fenotipos en el Programa MBP de UC Davis, y a Michael Kosicki del Laboratorio de Berkeley por su ayuda con la bioinformática.

División de Genómica Ambiental y Biología de Sistemas, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, 1 Cyclotron Road, Berkeley, CA, 94720, EE. UU.

Sudha Rajderkar, Iros Barozzi, Yiwen Zhu, Yoko Fukuda-Yuzawa, Guy Kelman, Adyam Akeza, Quan Pham, Anne N. Harrington, Janeth Godoy, Eman M. Meky, Kianna von Maydell, Riana D. Hunter, Jennifer A. Akiyama, Catherine S. Novak, Ingrid Plajzer-Frick, Veena Afzal, Stella Tran, Diane E. Dickel, Axel Visel y Len A. Pennacchio

Centro de Investigación del Cáncer, Universidad Médica de Viena, Borschkegasse 8a, 1090, Viena, Austria

Iros Barozzi

Departamento de Cirugía y Cáncer, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Iros Barozzi

Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, La Jolla, CA, EE. UU.

Rong Hu, Yanxiao Zhang, Bin Li y Bing Ren

Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC-Universidad Pablo de Olavide Junta de Andalucía, 41013, Seville, Spain

Ana Alcaina Caro & Javier López-Rios

Instituto de Biociencias Avanzadas, Universidad de Keio, Tsuruoka, Yamagata, Japón

Yoko Fukuda Yuzawa

Centro de Medicina Computacional Personalizada de Jerusalén, Universidad Hebrea de Jerusalén, Jerusalén, Israel

Guy Kelman

Instituto Conjunto del Genoma del Departamento de Energía de EE. UU., 1 Cyclotron Road, Berkeley, CA, 94720, EE. UU.

Matthew J. Blow, Axel Visel y Len A. Pennacchio

Centro de Medicina Genómica, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, 02114, EE. UU.

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Programa en Genética Médica y Poblacional y Centro Stanley de Trastornos Psiquiátricos, Broad Institute of Harvard y Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02142, EE. UU.

Michael E. Talkowski

Departamento de Neurología, Hospital General de Massachusetts y Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, 02114, EE. UU.

Michael E. Talkowski

Programa de Biología del Ratón, Universidad de California, Davis, Davis, CA, EE. UU.

KC Kent Lloyd

Departamento de Cirugía, Facultad de Medicina, Universidad de California, Davis, Davis, CA, EE. UU.

KC Kent Lloyd

Centro de Epigenómica, Universidad de California, Facultad de Medicina de San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Bing Ren

Departamento de Medicina Celular y Molecular, Universidad de California, Facultad de Medicina de San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Bing Ren

Instituto de Medicina Genómica, Moores Cancer Center, Universidad de California, Facultad de Medicina de San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Bing Ren

Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de California, Merced, Merced, CA, EE. UU.

Axel Visel

Programa de Bioquímica Comparada, Universidad de California, Berkeley, CA, 94720, EE. UU.

Len A. Pennacchio

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SR, IB, DED, AV y LAP diseñaron el estudio. SR e IB idearon la estrategia de priorización para identificar los límites de TAD para la eliminación experimental; IB realizó el análisis correlativo con la ayuda de YFY. SR, Y. Zhu, AAC, RH, AA, QP, ANH, JG, EMM, KVM, RDH, JAA, CSN, IP-F., VA y ST realizaron experimentos, incluida la generación y caracterización de ratones knockout. KCKL supervisó el esfuerzo de fenotipado de KOMP2 en el Programa de Biología del Ratón de UC Davis. JL-R. y BR coordinaron y supervisaron experimentos en CABD, CSIC-Universidad Pablo de Olavide Junta de Andalucía, 41013 Sevilla, España, y Universidad de California, Facultad de Medicina de San Diego, La Jolla, CA, EE. UU., respectivamente. SR, Y. Zhang, BL, GK, MB y MT analizaron los datos. SR, DED, AV y LAP escribieron el manuscrito con aportaciones de los autores restantes.

Correspondencia a Axel Visel o Len A. Pennacchio.

BR es cofundador de Arima Genomics, Inc y Epigenome Technologies, Inc. Otros autores no tienen intereses competitivos que declarar.

Trabajamos para garantizar el equilibrio de sexos en la selección de sujetos no humanos. Trabajamos para garantizar la diversidad en muestras experimentales mediante la selección de conjuntos de datos genómicos. Uno o más de los autores de este artículo se identifican como una minoría étnica subrepresentada en la ciencia. Uno o más de los autores de este artículo recibieron apoyo de un programa diseñado para aumentar la representación de las minorías en la ciencia. Si bien citamos referencias científicamente relevantes para este trabajo, también trabajamos activamente para promover el equilibrio de género en nuestra lista de referencias. La lista de autores de este artículo incluye contribuyentes del lugar donde se realizó la investigación que participaron en la recopilación de datos, el diseño, el análisis y la interpretación del trabajo.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. Este documento solo contiene comentarios de revisores y cartas de refutación para las versiones consideradas en Communications Biology. Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Zhijuan Qiu y George Inglis.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Rajderkar, S., Barozzi, I., Zhu, Y. et al. Se requieren límites de dominio de asociación topológica para el funcionamiento normal del genoma. Común Biol 6, 435 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04819-w

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Recibido: 15 de diciembre de 2022

Aceptado: 06 de abril de 2023

Publicado: 20 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04819-w

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